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中國疾控中心主任高福院士論文:中國肺炎患者的新冠病毒

2020/1/30 20:32:35來源:作者:作者|高福、翻譯|王冠蘇責編:騎士評論:

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中國疾控中心回應新冠病毒論文質疑:系回顧性分析,去年12月中旬已“人傳人”

本文于1月24日發表于《新英格蘭醫學雜志》

作者|高福(中科院院士,中國疾控中心主任)

【綜述】

2019年12月,一群不明原因的肺炎患者被發現與中國武漢一家海鮮批發市場有關。通過對肺炎患者的樣本進行無偏序測序,發現了一種以前不為人知的次冠狀病毒(β-回旋病毒)。人類氣道上皮細胞被用來分離一種新的冠狀病毒,命名為2019-nCoV,它在sarbecvirus亞屬,Orthocoronavirinae亞科(sarbecovirus的正冠狀病毒亞科中)中形成一個分支。與MERS-CoV和SARS-CoV不同,2019-nCoV是感染人類的冠狀病毒家族中的第7個成員。正在對其加強監測和進一步調查。(由國家重點研究開發項目、國家傳染病防治重點項目資助)

新出現和重新出現的病原體是對公共衛生的全球性挑戰。冠狀病毒是一種包膜RNA病毒,廣泛分布于人類、其他哺乳動物和鳥類中,可引起呼吸道、腸道、肝臟和神經系統疾病。已知有六種冠狀病毒會引起人類疾病。四種病毒- 229E、OC43、NL63和HKU1 -在具有免疫能力的個體中普遍存在并通常引起普通感冒癥狀。另外兩種毒株——嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)——最初是人畜共患的,有時與致命疾病有關。SARS-CoV是2002年和2003年廣東省暴發嚴重急性呼吸道綜合征疫情的病原體。MERS-CoV是2012年中東爆發嚴重呼吸系統疾病的病原體。鑒于冠狀病毒的高度流行和廣泛分布,其基因組的巨大遺傳多樣性和頻繁重組,以及人-動物界面活性的增加,由于頻繁的跨物種感染和偶爾的溢出事件,新的冠狀病毒可能在人類中周期性地出現。

在2019年12月下旬,幾家地方衛生機構報告了與中國湖北省武漢市一家海鮮和濕性動物批發市場有關的不明原因肺炎患者群集。2019年12月31日,中國疾病預防控制中心(中國疾病預防控制中心)派出快速反應小組,陪同湖北省和武漢市衛生當局進行流行病學和病原學調查。我們報告了這次調查的結果,確定了肺炎群集的來源,并描述了在肺炎患者中檢測到的一種新型冠狀病毒,這些患者的標本在疫情早期由中國疾病預防控制中心進行了檢測。我們還描述了其中兩例肺炎的臨床特征。

【研究方法】

病毒的診斷方法

收集了4例下呼吸道樣本,包括支氣管肺泡灌洗液,均來自于2019年12月21日或之后在武漢確診的不明原因肺炎患者,這些患者在接近臨床表現臨近時曾在華南海鮮市場出現過。收集7例北京醫院已知原因肺炎患者的支氣管肺泡灌洗液標本作為對照。按照制造商(Roche)的描述,從臨床樣本(包括作為陰性對照的未受感染的培養物)中提取核酸需要使用高純病毒核酸試劑盒。提取的核酸樣本按照制造商說明,使用RespiFinderSmart22kit (PathoFinder BV)和LightCycler 480 real-time PCR系統,通過聚合酶鏈反應(PCR)檢測病毒和細菌。樣本分析了22種病原體(18種病毒和4種細菌),詳見附錄。此外,先前描述的無偏倚、高通量測序被用來發現無法通過上述方法識別的微生物序列。實時逆轉錄聚合酶鏈反應(rt - PCR)檢測用于檢測病毒RNA鍋β-CoV RdRp地區通過目標共識,如補充附錄所述。

病毒分離/篩分離法

偷窥438 电影隔離的病毒收集支氣管肺泡灌洗液樣本,置于無菌杯中,加入病毒載體。然后離心樣品以去除細胞碎片。上清接種在人氣道上皮細胞上,人氣道上皮細胞是從肺癌患者手術切除的氣道標本上獲得的,經NGS證實為無特定病原體。

偷窥438 电影將人氣道上皮細胞擴張到塑料基質上,生成傳代-1細胞,然后在可滲透的Transwell-COL(直徑12毫米)支架上以每孔2.5 105個細胞的密度鍍覆。將人氣道上皮細胞培養在空氣-液體界面中培養4 - 6周,形成分化良好的極化培養物,類似于體內假層狀黏液上皮。

感染前,用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗人氣道上皮細胞頂面三次;支氣管肺泡灌洗液樣品上清液150μl接種于細胞培養物的頂面。在37℃孵育2小時后,用500μl磷酸鹽緩沖鹽水沖洗10分鐘,將人呼吸道上皮細胞維持在37℃、5%二氧化碳的空氣-液體界面中。每隔48小時,將150μl磷酸鹽緩沖液涂在人氣道上皮細胞的頂端表面,在37℃下孵育10分鐘后采集樣本。假層狀粘液上皮細胞在此環境中得以維持;根尖標本以1:3稀釋的瓶狀液傳代至新細胞。每天用光鏡觀察細胞病變,用RT-PCR檢測上清液中是否存在病毒核酸。三次傳代后,制備根尖標本和人氣道上皮細胞進行透射電鏡觀察。

透射電子顯微鏡法

偷窥438 电影收集具有細胞病變作用的人氣道上皮細胞培養物上清液,用2%多聚甲醛滅活至少2小時,超速離心使病毒顆粒沉淀。濃縮上清液在覆膜網格上呈陰性染色進行檢測。收集具有細胞病變作用的人氣道上皮細胞,用2%對甲醛- 2.5%戊二醛固定,用1%四氧化鋨脫水,用級乙醇包埋PON812樹脂固定。切片(80 nm)從樹脂塊上切下,分別用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛(醋酸鈾和檸檬酸鉛)染色。透射電鏡下觀察陰性染色網格和超薄切片。

病毒基因組測序

偷窥438 电影以支氣管肺泡灌洗液和培養上清液中提取的RNA為模板進行基因組克隆和測序。我們使用Illumina測序和nanopore測序相結合的方法來描述病毒基因組。使用CLC Genomics軟件version 4.6.1 (CLC Bio)將序列序列序列組裝成contig圖譜(一組重疊的DNA片段)。隨后設計特異性引物進行PCR,并使用5′- 或者3′- 小種 (cDNA末端快速擴增)填補常規Sanger測序的基因組空白。這些PCR產物從凝膠中純化,按照制造商的說明,使用BigDye Terminator v3.1循環測序試劑盒和3130XL基因分析儀進行測序。利用肌肉對2019-nCoV和參考序列進行多序列比對。利用RAxML(13)進行全基因組的系統發育分析,共進行了1000次自舉復制,并建立了一個通用的時間可逆模型作為核苷酸替代模型。

【結論】

患者

2019年12月27日,武漢一家醫院收治3名成人重癥肺炎患者。患者1為49歲女性,患者2為61歲男性,患者3為32歲男性。臨床資料可用于患者1和2。患者1報告沒有潛在的慢性疾病,但于2019年12月23日出現發燒(溫度,37°C至38°C)和咳嗽伴有胸部不適。發病4天后,她的咳嗽和胸部不適加重,但發燒減輕;肺炎的診斷是基于計算機斷層掃描。她的職業是海鮮批發市場的零售商。患者2最初于2019年12月20日報告發燒和咳嗽;發病7天后出現呼吸窘迫,并在接下來的2天內惡化(見胸片,圖1),此時開始機械通氣。他是海鮮批發市場的常客。患者1和3于2020年1月16日康復出院。患者2于2020年1月9日死亡。未獲得活檢標本。

一種新型冠狀病毒的檢測與分離

2019年12月30日于武漢金銀潭醫院采集3例支氣管肺泡灌洗標本。用RespifinderSmart22試劑盒在這些患者的臨床標本中未檢測到特定病原體(包括HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1)。以從患者支氣管肺泡灌洗液中提取的RNA為模板,采用Illumina測序和納米孔測序相結合的方法克隆和測序基因組。從單個樣本中獲得20000多個病毒片段,并且大多數疊連群與來自betacoronavirus屬B系的基因組匹配-顯示出與之前公布的蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat-SL-CoVZC45,MG772933.1)基因組呈現85%以上的一致性。用實時RT-PCR檢測RNA靶向panβ-CoV的RdRp區(盡管檢測樣品的循環閾值高于34),也獲得了陽性結果。用人氣道上皮細胞和Vero E6、Huh-7細胞株進行病毒分離。分離出的病毒名為2019- nCoV。

偷窥438 电影為了確定病毒顆粒是否能在2019年nCoV感染的人氣道上皮細胞中看到,在接種后6天,每天用光學顯微鏡和透射電鏡檢查模擬感染和2019年nCoV感染的人氣道上皮細胞培養物。接種后96小時觀察到人氣道上皮細胞表面層的細胞病變作用;病灶中心光鏡下可見纖毛搏動缺失(圖2)。接種后6d,Vero E6和Huh-7細胞系未觀察到特異性細胞病變。

偷窥438 电影負染色的2019個nCoV粒子的電子顯微照片通常是球形的,具有一些多形性(圖3)。直徑從60到140納米不等。病毒粒子有非常獨特的尖峰,約9至12納米,使病毒粒子看起來像日冕。在人氣道上皮超薄切片可見胞外游離病毒顆粒和胞質膜結合小泡內充滿病毒顆粒的包涵體。觀察到的形態與冠狀病毒科一致。

為進一步鑒定該病毒,通過Illumina和nanopore測序,從臨床標本(支氣管肺泡灌洗液)和人氣道上皮細胞病毒分離株中獲得2019個nCoV基因組的從頭序列。新的冠狀病毒是從三個病人身上鑒定出來的。從支氣管肺泡灌洗液(BetaCoV/huanzhou/IVDC-HB-04/2020,BetaCoV/huanzhou/IVDC-HB-05/2020,EPI-ISL-u402121)中獲得兩個近全長的冠狀病毒序列,并從從患者分離的病毒(BetaCoV/huanzhou/IVDC-HB-01/2020,EPI-ISL-u402119)中獲得一個全長序列。

將三種新型冠狀病毒的全基因組序列提交給GISAID(BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019,加入ID:EPI_ISL_402119;BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020,加入ID:EPI_ISL_402120;BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2019,加入編號:EPI_ISL_402121),與先前發表的蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat-SL-CoVZC45,MG772933.1)基因組具有86.9%的核苷酸序列同源性。這三個2019-nCoV基因組聚集在sarbecev亞屬內,表現出典型的倍錐病毒組織:5個未翻譯區(UTR)、復制酶復合體(orf1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3個UTR,以及幾個未識別的非結構開放閱讀框。

盡管2019-nCoV與蝙蝠體內檢測到的一些β-回旋病毒相似(圖4),但它與SARS-CoV和MERS-CoV不同。來自武漢的3株2019-nCoV冠狀病毒與兩株蝙蝠源SARS樣株ZC45和ZXC21形成了一個明顯的分支。來自人類的SARS-CoV株和來自中國西南部蝙蝠的遺傳相似的SARS樣冠狀病毒在sarbecovirus亞屬內形成了另一個分支。由于2019-nCoV與betacoronavirus其他成員在保守復制酶結構域(ORF 1ab)中的序列同源性小于90%,因此2019年nCoV是武漢地區病毒性肺炎的可能致病因子,是冠狀病毒科sarbecvirus亞屬的新型倍他冠狀病毒。

【討論】

我們報告了一種新的CoV(2019- nCoV),于2019年12月和2020年1月在中國武漢的住院患者中發現。該病毒存在的證據包括通過全基因組測序、直接PCR和培養在三名患者的支氣管肺泡灌洗液中鑒定。這種可能由這種冠狀病毒引起的疾病被稱為“新型冠狀病毒感染性肺炎”(NCIP)。完整的基因組被提交給GISAID。系統發育分析顯示,2019-nCoV屬于betacornavirus屬,包括在人類、蝙蝠和其他野生動物中發現的冠狀病毒(SARS-CoV、蝙蝠類SARS-CoV等)。我們報道了病毒的分離及其特異性細胞病變效應和形態學的初步描述。

多年來,分子技術已成功地用于傳染源的鑒定。無偏見、高通量測序是發現病原體的有力工具。下一代測序和生物信息學正在改變我們應對傳染病爆發的方式,提高我們對疾病發生和傳播的認識,加快病原體的鑒定,促進數據共享。我們在本報告中描述了利用分子技術和無偏DNA測序發現一種新的β-輪狀病毒,該病毒可能是中國武漢三名患者重癥肺炎的病因。

雖然建立人氣道上皮細胞培養是勞動密集型的,但它們似乎是分析人呼吸道病原體的一個有價值的研究工具我們的研究表明,呼吸道分泌物最初在人氣道上皮細胞培養物上增殖,然后用透射電子顯微鏡和培養上清的全基因組測序成功地用于觀察和檢測新的人冠狀病毒,這可能是傳統方法無法識別的。

偷窥438 电影進一步發展準確、快速的方法來識別未知的呼吸道病原體仍然是需要的。在分析本研究獲得的3個完整基因組的基礎上,我們設計了幾種針對2019-nCoV基因組ORF1ab、N和E區域的特異性和敏感性分析,以檢測臨床標本中的病毒RNA。這些引物和標準操作程序已與世界衛生組織共享,用于在全球和中國監測和檢測2019-nCoV感染。最近的數據顯示,2019年,中國有830人檢測出ncov。

偷窥438 电影盡管我們的研究不符合科赫的假設,但我們的分析提供了證據,表明2019-nCoV與武漢疫情有關。證實武漢疫情中2019-nCoV的病原學意義的其他證據包括通過免疫組化分析在患者肺組織中鑒定2019-nCoV抗原,在兩個時間點檢測患者血清樣本中的IgM和IgG抗病毒抗體以證明血清轉化,以及動物(猴子)實驗來提供致病性的證據。至關重要的是進行流行病學調查,以確定感染導致的傳播模式、繁殖間隔和臨床譜,從而為制定預防、控制和制止2019-nCoV傳播的戰略提供信息和改進。

這項工作得到了國家重點研究開發項目(2016YFD0500101)和國家傳染病防治重大項目(2018ZX1001002)的資助。

作者提供的公開表格可以在NEJM.org上獲得本文的全文。

朱博士、張博士、王博士、李博士和楊博士對本文的貢獻是一樣的。

偷窥438 电影本文于2020年1月24日發表,并于2020年1月29日在NEJM.org上更新。

我們感謝李中杰博士、何廣學博士、蘭斯·羅德瓦爾德博士、于力博士、費葉博士、李昭博士、周偉民博士、劉軍博士、姚蒙博士、王慧娟博士以及中國疾控中心的許多工作人員,感謝他們在編寫和提交早期版本的手稿方面所作的貢獻和幫助。

【第一作者單位】

偷窥438 电影中國疾病預防控制中心國家病毒性疾病預防控制所生物安全重點實驗室,

偷窥438 电影北京首都醫科大學地壇醫院傳染病科;

湖北省疾病預防控制中心(B.Y, F.Z.)、

偷窥438 电影中國科學院生物安全特大型科學中心(W.T.)、

偷窥438 电影湖北省疾病預防控制中心(B.Y.,F.Z.)、武漢市金銀灘醫院(D.Z.);

偷窥438 电影山東第一醫科大學和山東醫學科學院,山東濟南(W.S.)。

偷窥438 电影中國疾病預防控制中心國家病毒性疾病預防控制所生物安全重點實驗室,譚博士,高博士,吳博士

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